dns试剂与糖

一、DNS试剂

定义：DNS试剂即二硝基水杨酸试剂，是一种常用于还原糖含量测定的化学试剂。

化学组成：主要成分包括3,5 二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚和亚硫酸钠等。

配制方法

常见配方一：将6.3克3,5 二硝基水杨酸和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，贮于棕色瓶中备用。

常见配方二（Ghose法）

甲液：将6.9g结晶苯酚溶于15.2ml 10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。

乙液：将255g酒石酸钾钠溶于300ml 10%NaOH溶液中，再加入880ml 1%的3,5 二硝基水杨酸溶液。

将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7 10d后使用。

注意事项：在配制过程中，3,5 二硝基水杨酸和NaOH的加入时间要相近，否则易产生难溶沉淀导致配制失败；溶液加热温度不宜过高，一般不超过50℃，且配制好的试剂需贮于棕色瓶中避光保存。

储存条件及有效期：一般室温下存放于棕色瓶中，避光保存，不同配制方法的试剂有效期略有不同，如农业部标准配制的DNS试剂有效期为6个月。

二、糖的分类及性质

按还原性分类

还原糖：是指含有自由醛基或酮基的糖类，如葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖，以及麦芽糖、乳糖等双糖，它们在碱性条件下可被氧化，具有还原性。

非还原糖：如蔗糖、淀粉等，分子中没有游离的醛基或酮基，在通常情况下不具有还原性，但在一定条件下（如酸水解）可转化为还原糖。

其他分类方式

按聚合度分类：可分为单糖、双糖、多糖等，单糖是不能水解的最简单的糖；双糖是由两个单糖分子脱水缩合而成；多糖是由多个单糖分子聚合而成，如淀粉、纤维素等。

按来源分类：可分为植物源糖（如蔗糖、淀粉等）、动物源糖（如葡萄糖、半乳糖等）和微生物源糖等。

三、DNS试剂与糖的反应原理

反应条件：在碱性条件下，DNS试剂与还原糖共热发生氧化还原反应。

反应过程：还原糖在碱性加热条件下被氧化成糖酸及其它产物，而DNS试剂中的3,5 二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3 氨基 5 硝基水杨酸。

颜色变化及定量依据：在一定浓度范围内，还原糖的量与生成的棕红色物质颜色的深浅成正比关系，通过在540nm波长下测定吸光度值，可建立标准曲线，进而计算样品中还原糖的含量。

四、DNS试剂测定糖含量的操作步骤

葡萄糖标准曲线的绘制

分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15ml试管中，用蒸馏水补足至1.0ml。

分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。

在540nm波长下测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定

样品液适当稀释，使糖浓度为0.1 1.0mg/ml。

取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度。

在540nm波长下测定吸光度，从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数，求出样品中糖含量。

五、DNS试剂测定糖含量的影响因素及注意事项

影响因素

反应条件：如碱性程度、加热温度和时间等会影响反应的进行和显色效果，应严格控制反应条件的一致性，以确保测定结果的准确性。

样品处理：样品的提取、纯化和稀释等处理过程会影响测定结果，样品中存在其他干扰物质时，可能会与DNS试剂发生反应，导致测定结果偏高或偏低，需要对样品进行适当的预处理，以去除干扰物质。

仪器精度：分光光度计的波长准确性、比色皿的清洁度和透光性等也会影响吸光度的测定结果，在使用前，应确保仪器经过校准，比色皿清洁无污渍。

注意事项

DNS试剂应现用现配，或按照正确的储存方法保存，避免试剂变质影响测定结果。

在测定过程中，应严格按照操作步骤进行，特别是加入试剂的顺序和量、加热时间和温度等，以确保反应的一致性和准确性。

样品测定时应进行适当的稀释，使糖浓度在标准曲线的线性范围内，以保证测定结果的可靠性。

六、相关问题与解答

问题1：DNS试剂测定糖含量时，为什么选择540nm波长进行吸光度测定？

解答：在DNS试剂与还原糖的反应中，生成的棕红色物质3 氨基 5 硝基水杨酸在540nm波长处有最大吸收峰，选择此波长进行吸光度测定，可以获得最灵敏和准确的测定结果，因为在该波长下，吸光度与物质浓度的关系最符合朗伯 比尔定律，能够更好地反映还原糖的含量。

问题2：如果样品中含有非还原糖，如何用DNS试剂测定其总糖含量？

解答：对于含有非还原糖的样品，需要先通过酸水解等方法将非还原糖转化为还原糖，然后再用DNS试剂进行测定，对于淀粉等多糖，可先用浓盐酸在高温下将其水解为葡萄糖等还原糖，然后调节溶液的pH值至碱性，再按照DNS试剂测定还原糖的方法进行操作，最后根据标准曲线计算出总糖含量，需要注意的是，在水解过程中要严格控制条件，以确保非还原糖完全水解为还原糖，同时避免产生其他副反应影响测定结果。