dns测还原糖实验计算

DNS法测定还原糖实验计算

实验目的

通过3,5二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量，掌握该方法的原理、操作步骤及数据处理方法,能够准确计算样品中还原糖的含量。

实验原理

DNS法基于在碱性条件下，3,5二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度呈正比，通常可在540nm波长下测定吸光度,进而通过与标准曲线对比计算出样品中还原糖的含量。

（一）化学反应原理

$$text{还原糖}+text{DNS试剂}xrightarrow{Delta}text{棕红色物质}$$
该棕红色物质在特定波长下有特征吸光度，且吸光度与还原糖浓度遵循朗伯 比尔定律，即$$A = varepsilon cl$$（$A$$为吸光度，$$varepsilon$$为摩尔吸光系数，$$c$$为溶液浓度，$$l$$为比色皿光径长度）。

（二）标准曲线法原理

配制一系列已知浓度的还原糖标准溶液，分别与DNS试剂反应后测定吸光度，以吸光度为纵坐标，还原糖浓度为横坐标绘制标准曲线，当测定样品与DNS试剂反应后的吸光度时，即可从标准曲线上查得对应的还原糖浓度,再根据样品的稀释倍数等计算样品中实际的还原糖含量。

实验材料与仪器

（一）材料

1. 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥至恒重的葡萄糖$$100mg$$，加水溶解并定容至$$100mL$$，得到$$1mg/mL$$的葡萄糖标准溶液。
2. 待测样品液：例如果蔬汁、发酵液等经适当处理后的液体,确保其中还原糖溶解且无杂质干扰测定。

（二）仪器

1. 试管及试管架若干
2. 移液枪（量程覆盖所需移液体积）及配套枪头
3. 容量瓶（$$100mL$$、$$25mL$$等）
4. 电炉及石棉网（用于加热煮沸）
5. 分光光度计（可精确测定$$540nm$$处吸光度）
6. 具塞刻度试管（用于反应及比色）
7. 洗耳球

实验步骤

（一）标准曲线的制作

1. 取$$7$$支具塞刻度试管，编号为$$0 6$$，按表1进行操作。
   |试管编号|葡萄糖标准溶液（mL）|蒸馏水（mL）|DNS试剂（mL）|还原糖浓度（mg/mL）|
   |::|::|::|::|::|
   |0|0|1.0|1.5|0|
   |1|0.2|0.8|1.5|0.2×1=0.2|
   |2|0.4|0.6|1.5|0.4×1=0.4|
   |3|0.6|0.4|1.5|0.6×1=0.6|
   |4|0.8|0.2|1.5|0.8×1=0.8|
   |5|1.0|0.0|1.5|1.0×1=1.0|
   |6|1.2|0.2|1.5|1.2×1=1.2|
   注：表中“0.2”表示需从原溶液中取出相应体积，保证总体积为$$2.5mL$$。
2. 将各试管摇匀，在沸水浴中加热$$5min$$，取出后立即用流水冷却至室温，再用蒸馏水定容至$$25mL$$,摇匀。
3. 以试管0号为空白对照，在$$540nm$$波长处，用$$1cm$$比色皿测定各试管溶液的吸光度,记录数据。

（二）待测样品的测定

1. 取一支具塞刻度试管，加入待测样品液$$1.0mL$$，再加入DNS试剂$$1.5mL$$,摇匀。
2. 同标准曲线制作中的加热、冷却及定容操作，定容至$$25mL$$。
3. 以空白对照（可用蒸馏水代替样品液，同上操作）调节分光光度计零点，测定样品管在$$540nm$$处的吸光度，重复测定三次,取平均值。

数据处理与计算

（一）绘制标准曲线

以葡萄糖标准溶液浓度（$$mg/mL$$）为横坐标，吸光度为纵坐标，在坐标纸上或使用绘图软件绘制标准曲线，求出回归方程$$y = ax + b$$（$y$$为吸光度，$$x$$为还原糖浓度，$$a$$为斜率，$$b$$为截距）。

（二）计算样品中还原糖含量

1. 根据样品管测得的平均吸光度，代入标准曲线回归方程，计算出样品液中还原糖的浓度（$$C_{1}$$，单位：$$mg/mL$$）。
2. 若样品进行了稀释，设稀释倍数为$$n$$，则样品中实际还原糖含量（$$X$$，单位：$$mg/g$$或$$mg/mL$$，根据样品性质而定）计算公式为：
   $$X = C{1}times ntimesfrac{V{1}}{V{2}}$$
   $$V{1}$$为样品提取液总体积，$$V_{2}$$为测定时所取样品提取液体积。

注意事项

1. 实验中所有试管编号要清晰，移液操作要准确，尤其是DNS试剂的加入量要一致,以保证反应条件的一致性。
2. 加热过程中要注意安全，避免烫伤及溶液暴沸溢出，加热时间要严格控制,否则会影响显色效果及测定准确性。
3. 分光光度计使用前要预热并调零，比色皿要洁净，透光面要擦拭干净，避免划痕影响透光率，测定时要保证比色皿放置位置正确,防止漏光。
4. 绘制标准曲线时，各标准点应呈良好线性关系，若个别点偏离较大，应检查操作是否有误,必要时重新测定。

相关问题与解答

（一）问题1：为什么DNS法测定还原糖时要设置空白对照？

解答：设置空白对照的目的是消除试剂本身颜色及其他非还原糖因素对吸光度测定的影响，在实验中，DNS试剂在未与还原糖反应时也有一定的颜色，通过以蒸馏水代替样品液，同样加入DNS试剂并进行相同操作处理作为空白对照，在分光光度计上调节零点，可以扣除试剂背景色，使后续样品测定的吸光度能真实反映还原糖与DNS试剂反应产生的颜色变化,从而准确计算出样品中还原糖的含量。

（二）问题2：如果样品颜色过深，对DNS法测定还原糖有何影响？该如何解决？

解答：如果样品颜色过深，会干扰吸光度的测定，因为吸光度是溶液中所有成分对光吸收的综合结果，深色样品本身会使吸光度偏高，导致测定的还原糖含量不准确，解决方法有以下几种，一是对样品进行脱色处理，例如对于果蔬汁样品，可采用活性炭吸附法，在样品中加入适量活性炭，搅拌后过滤，去除部分色素，但要注意活性炭不能过量，以免吸附还原糖，二是增大样品的稀释倍数，降低样品中有色物质的浓度，但稀释倍数过大可能会使测定灵敏度降低，所以需要根据实际情况选择合适的稀释倍数，同时在计算时要考虑稀释倍数对结果的影响，也可以尝试采用其他更合适的检测方法，如离子交换色谱法等，但对于教学或常规检测，优先通过上述简单处理来改善DNS法的