dns法 淀粉酶活性

DNS法测定淀粉酶活性实验详解

淀粉酶与酶活性

1 淀粉酶的基本特性

淀粉酶（Amylase）是一类能催化淀粉水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，根据作用方式可分为α淀粉酶（随机水解α1,4糖苷键）和β淀粉酶（从非还原端水解麦芽糖单位），本文以α淀粉酶为例，采用DNS法（3,5二硝基水杨酸法）测定其活性。

2 酶活性的定义

酶活性指单位时间内酶催化底物反应的速率,常用国际单位U表示：

• 1 U = 在特定条件下，每分钟催化底物转化1μmol所需的酶量

DNS法测定原理

1 化学反应机制

DNS法基于还原糖与3,5二硝基水杨酸（DNS）的显色反应：

1. 还原糖生成：淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖、葡萄糖等还原糖
2. 显色反应：在沸水浴条件下，DNS与还原糖共热生成棕红色络合物（λmax=540nm）
3. 定量依据：吸光度值与还原糖浓度成正比，通过标准曲线计算酶活性

2 方法优势

实验材料与仪器

1 试剂配制

2 仪器设备

操作步骤详解

1 标准曲线制作

1. 取7支试管按表1梯度稀释葡萄糖标准液
2. 各管加DNS试剂2mL,沸水浴5min显色
3. 冷却后补水至25mL,540nm测吸光度

表1 葡萄糖标准系列
| 管号 | 葡萄糖体积(mL) | 蒸馏水(mL) | 终浓度(mg/mL) |
|||||
| 0 | 0 | 1 | 0 |
| 1 | 0.2 | 0.8 | 0.2 |
| 2 | 0.4 | 0.6 | 0.4 |
| … | … | … | … |
| 6 | 1.0 | 0 | 1.0 |

2 酶促反应体系

反应体系（mL）
| 组分 | 体积 | 终浓度/条件 |
||||
| 淀粉溶液 | 1 | 1% (w/v) |
| 磷酸盐缓冲液 | 0.5 | pH6.8, 0.1M |
| 酶液 | 0.5 | 适当稀释 |
| 总体积 | 2 | |

操作流程

1. 37℃预热反应体系5min
2. 加入酶液立即混匀并计时
3. 反应5min后加入2mL DNS终止反应
4. 沸水浴5min显色,冷却后5000rpm离心10min
5. 取上清液测A540值

3 对照实验设置

数据处理与计算

1 标准曲线绘制

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A540为纵坐标，建立线性回归方程：
[ y = kx + b ]
（示例：y=0.85x+0.015，R²>0.99）

2 酶活性计算

1. 样品浓度计算：根据A540值代入标准曲线方程，得还原糖浓度C（mg/mL）
2. 酶活性公式：
   [ text{酶活性} (text{U/mL}) = frac{C times V_t times n}{V_s times t} ]

• ( V_t ): 反应总体积（mL）=2.5mL
• ( n ): 稀释倍数=酶液稀释倍数×反应体积/取样体积
• ( V_s ): 取样体积（mL）=0.5mL
• ( t ): 反应时间（min）=5min

示例计算：若测得A540=0.45，查标准曲线得C=0.5mg/mL，酶液稀释10倍：
[ text{酶活性} = frac{0.5 times 2.5 times (2/0.5)}{0.5 times 5} = 4 , text{U/mL} ]

注意事项与误差分析

1 关键控制点

2 常见误差来源

相关问题与解答

Q1：DNS显色时为何需要沸水浴？能否用其他温度？

A：沸水浴（100℃）可使DNS与还原糖快速缩合生成稳定有色物，若温度低于90℃，显色速度显著下降且反应不完全；高于100℃可能破坏糖结构，因此必须严格控温。

Q2：测得酶活性明显高于预期，可能原因有哪些？

A：主要原因包括：

1. 酶液浓度过高：底物过早耗尽导致假性高活性，建议增加稀释倍数
2. 反应时间过长：超过5min会使产物积累偏离线性区间
3. 底物浓度不足：淀粉溶液浓度过低（<0.5%）时无法饱和酶活性中心
4. 显色干扰：样品中含蛋白质等DNS反应干扰物，需增设样本空白对照