DNS法测定还原糖浓度
实验原理
DNS（3,5二硝基水杨酸）比色法是一种常用的测定还原糖含量的方法，其基本原理是在碱性条件下，DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成棕红色的氨基化合物，这种产物在煮沸条件下会呈现更明显的颜色变化，且颜色的深浅与还原糖的浓度成正比，由于DNS法显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，因此该方法特别适用于多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）的水解产物中还原糖的测定。
实验步骤
制作葡萄糖标准液
取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml试管中，用蒸馏水补足至1.0ml，这一步骤是为了建立葡萄糖浓度与吸光度之间的关系,即制作标准曲线。
添加DNS试剂
向上述试管中分别加入1.5ml DNS试剂，混匀后置于沸水浴中加热5分钟,以终止反应并显色。
冷却与稀释
取出试管后立即用冷水冷却,然后加入4ml蒸馏水稀释。
比色测定
将上述溶液倒入比色皿中，使用分光光度计在540nm波长下测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
样品测定
对于待测样品，首先进行适当的稀释，使其还原糖浓度落在标准曲线范围内，然后按照上述步骤进行操作，测定其吸光度,根据标准曲线计算出样品中的还原糖浓度。
DNS试剂的制备
DNS试剂通常由以下成分组成：3,5二硝基水杨酸1g、酒石酸钾钠20g、氢氧化钠10g以及苯酚（或苯酸钠）0.5g，这些成分需要先溶解在一定量的蒸馏水中，然后在热浴中充分溶解，并定容至1000ml，需要注意的是，DNS试剂应保存在棕色瓶中，避光保存,以防止试剂失效。
葡萄糖标准曲线的绘制
通过制作不同浓度的葡萄糖标准液，并按照上述步骤进行显色和比色测定，可以得到一系列葡萄糖浓度与吸光度的数据点，将这些数据点绘制成标准曲线，即可用于后续样品中还原糖浓度的计算，标准曲线的线性范围通常较宽，但为了保证测量的准确性,应尽量使样品的吸光度落在标准曲线的线性范围内。
注意事项
- 试剂的新鲜度：DNS试剂应现用现配,以保证其活性和准确性。
- 显色条件的控制：显色时需严格控制温度和时间,以确保颜色反应的充分进行。
- 样品的预处理：对于含有杂质较多的样品，需要进行适当的预处理，如过滤或离心等,以避免干扰测定结果。
- 仪器的准确性：分光光度计在使用前应进行校准,以确保测定结果的准确性。
相关问题与解答
Q1: DNS法测定还原糖浓度时，为什么需要使用NaOH和丙三醇？
A1: NaOH和丙三醇的存在可以提供碱性环境，促进DNS与还原糖之间的氧化还原反应，丙三醇还可以起到稳定剂的作用,防止DNS试剂在高温下分解。
Q2: 如果样品的吸光度超出了标准曲线的范围怎么办？
A2: 如果样品的吸光度超出了标准曲线的范围,说明样品中的还原糖浓度过高或过低。
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