DNS法测总糖含量

使用DNS法测定总糖含量的详细内容：

原理

DNS法全称3,%ignore_a_3%杨酸法，其原理是基于在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物，在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收峰，由于在一定浓度范围内，还原糖的含量与溶液的光吸收值呈线性关系，因此可以通过比色法测量溶液的吸光度来计算样品中的含糖量。

试剂与器材

操作步骤

（一）葡萄糖标准曲线制作

取8支15mm×180mm试管，按表1加入不同体积的葡萄糖标准液和蒸馏水。

表1 葡萄糖标准曲线制作试剂添加表
|管号|葡萄糖标准液（ml）|蒸馏水（ml）|葡萄糖含量（mg）|
|||||
|0|0|1.0|0|
|1|0.2|0.8|0.2|
|2|0.4|0.6|0.4|
|3|0.6|0.4|0.6|
|4|0.8|0.2|0.8|
|5|1.0|0|1.0|

2. 将各管溶液混合均匀,在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入10ml蒸馏水，摇匀。
3. 在λ = 540nm处测定吸光度，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

（二）样品中还原糖的提取

1. 准确称取0.5g小麦（淀）粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水（约2ml）调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀。
2. 于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。
3. 过滤,将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（三）样品总糖的水解及提取

1. 准确称取0.5g小麦(淀)粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热。
2. 取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I KI溶液检查水解是否完全，如已水解完全，则不呈现蓝色。
3. 水解毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

（四）样品中含糖量的测定

按表2进行操作。

表2 样品含糖量测定试剂添加表
|试剂空白/样品溶液|还原糖/总糖|蒸馏水（ml）|DNS试剂（ml）|
|||||
|试剂空白| |1.0|1.5|
|样品溶液|还原糖| |1.5|
||总糖| |1.5|

将各管溶液混合均匀,在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入10ml蒸馏水，摇匀，在λ = 540nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中的还原糖和总糖含量。

结果处理

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：
[含糖量(%)=frac{Ctimes V}{mtimes 1000}times 100%]
式中：(C)──还原糖或总糖提取液的浓度，(mg/ml)；(V)──还原糖或总糖提取液的总体积，(ml)；(m)──样品重量，(g)；(1000)──(mg)换算成(g)的系数。

注意事项

1. 实验过程中要注意控制反应条件,如温度、时间等，以保证实验结果的准确性和重复性。
2. DNS试剂应现用现配,或贮于棕色瓶中避光保存，防止变质。
3. 在测定吸光度时,要确保比色皿的清洁和透光性，避免影响测量结果。

相关问题与解答

问题1：DNS法测定总糖含量时，为什么要进行水解处理？
解答：因为样品中的总糖包括非还原糖，而DNS试剂只能与还原糖发生显色反应，通过水解处理，可以将非还原糖转化为还原糖，从而能够使用DNS法测定总糖含量。

问题2：如果DNS法测定的结果偏高，可能是什么原因？
解答：可能的原因有以下几点，一是样品中含有其他干扰物质，这些物质也可能与DNS试剂发生反应，导致吸光度偏高，从而使计算结果偏高；二是在操作过程中，如加热时间过长、温度过高等，可能会引起糖类的分解或其他副反应，影响测定结果；